Microproteínas urinarias en diabéticos tipo 2 normoalbuminúricos / Urinary microproteins in normoalbuminuric type 2 diabetic patients / Microproteínas urinárias em diabéticos tipo 2 normoalbuminúricos

En pacientes diabéticos tipo 2 normoalbuminúricos se observa la presencia de Microproteínas Urinarias (MU) en el rango 68-25 kDa. El objetivo del trabajo fue identificar en distintos estadios de la nefropatía diabética si dicho rango corresponde a un marcador de daño tubular. Se estudiaron 119 orinas espontáneas de pacientes diabéticos tipo 2; se les midió la relación albúmina/creatinina urinaria y la creatinina sérica. Se dividieron en 5 grupos: 71 normoalbuminúricos, 28 microalbuminúricos, 12 macroalbuminúricos, 2 urémicos en pre-diálisis y 6 en hemodiálisis. Las MU se detectaron en geles de poliacrilamida en 2 dimensiones para uso clínico y se analizaron con el programa Image J 1.30v. La identificación de las MU se realizó por “immunoblotting” o por espectrometría de masa MALDI-TOF-TOF. El 66% de los normoalbuminúricos presentaron las siguientes MU: orosomucoide, fragmento de 35 kDa de la cadena pesada H4 del inter alfa I inhibidor de tripsina y Beta Trace, las cuales no reflejaron daño tubular debido a que la concentración de las mismas no se incrementó en los pacientes en hemodiálisis, en comparación con los normoalbuminúricos. Dichas proteínas están vinculadas al endotelio vascular y podrían constituir un marcador urinario vascular-tubular renal de utilidad clínica en patologías sistémicas con riesgo cardiovascular y funcionalidad renal conservada.

Urinary excretion of microproteins (MU) was detected in normoalbuminuric type 2 diabetic patients, in the range of 68-25 kDa using SDS-PAGE with silver staining. The purpose of this study was to identify MU in diabetic patients in different grades of diabetic nephropathy, in order to clarify the diagnostic relevance as a marker of renal tubular damage. In the spontaneous urine of 119 type 2 diabetic patients, urinary albumin, urinary creatinine and serum were determined. Five groups were formed: 71 normoalbuminuric, 28 microalbuminuric, 12 macroalbuminuric, 2 in pre-dialysis and 6 in hemodialysis. The MU were separated by two-dimensional polyacrylamid gel electrophoresis for clinical use (2D UC) and were identified by immunoblotting or MALDI-TOF-TOF mass spectrometry and analyzed using Image J version 1.30v. Of the normoalbuminurics patients studied, 66% excreted the following MU: orosomucoid, 35 kDa fragment of inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H4 (ITIH4) and Beta Trace; but their concentrations did not reflect tubular damage because they exhibited a progressive downregulation. These proteins are involved in vascular endothelium, and they could be a marker of renal tubular-microvascular disease that would be useful in systemic diseases with cardiovascular risk and with preserved renal function.

Em pacientes diabéticos tipo 2 “normoalbuminúricos” se observa a presença de microproteínas urinárias (MU) em um intervalo compreendido entre 68 e 25 kDa. O objetivo do trabalho é identificar em distintos estágios da nefropatia diabética se tal intervalo corresponde a um marcador de dano tubular. Foram estudadas 119 amostras de urina espontânea de pacientes diabéticos tipo 2; foi medida a reação albumina/creatinina urinária e a creatinina sérica. Dividiram-se em 5 grupos: 71 normoalbuminúricos, 28 microalbuminúricos, 12 macroalbuminúricos, 2 urêmicos pré-dialise e 6 em hemodiálise. Foram detectadas as MU em géis de poliacrilamida em duas dimensões para o uso clínico e analisadas com o programa Image J versão 1.30v. A identificação das MU foi realizada por “immunoblotting” ou por espectrometria de massa MALDI-TOF-TOF. 66% de normoalbuminúricos apresentaram as seguintes MU: orosomucoide, Fragmento de 35 kDa da cadeia pesada H4 do interalfa inibidor da tripsina e Beta Trace, as quais não mostraram dano tubular devido a que a concentração das mesmas não está aumentada nos pacientes em hemodiálise, em comparação com os normoalbuminúricos. Estas proteínas estão envolvidas com o endotélio vascular e poderiam constituir um marcador urinário vascular-tubular renal de utilidade clínica em patologias sistêmicas com risco cardiovascular e funcionalidade renal conservada.

Gammapatía monoclonal de significado incierto: factores de pronóstico, evolución y riesgo / Monoclonal gammopathy of undeterminaded significance: prognostic factor and risk of progression / Gamopatia monoclonal de significado indeterminado: fatores prognósticos: risco da evolução

La Gammapatía Monoclonal de Significado Incierto (GMSI) tiene una prevalencia que varía entre 1 y 3%, su frecuencia tiende a aumentar con la edad y aunque presentan evolución indolente y una sobrevida prolongada, un porcentaje de ellas desarrollará una enfermedad maligna. Con el objetivo de evaluar el valor pronóstico de diversos parámetros proteicos y hematológicos al momento del diagnóstico, se estudiaron mediante estudios proteicos completos en sangre y en orina, 407 pacientes con diagnóstico de GMSI que ingresaron a la institución en el período comprendido entre 1982 y 2008. La concentración del componente monoclonal (CM) (>1,5 g/dL) y el tipo inmunológico (No IgG), la disminución de las inmunoglobulinas no comprometidas (INC), el porcentaje de infiltración de células plasmáticas en médula ósea (>5%) y la mediana de las relaciones anormales de las cadenas livianas monoclonales libres, fueron los parámetros que marcaron riesgo de progresión a una enfermedad maligna. El estudio proteico completo de orina demostró una asociación entre el aumento en la concentración de proteínas de bajo peso molecular con valores de estimado de filtración glomerular menor de 60 mL/min/1,73 m2 y presencia de proteinuria de Bence Jones, independientemente del tipo de cadena liviana y de los niveles de proteínas totales. Debido a ello, la adición de dichos marcadores de daño tubular podría ofrecer una visión más profunda, siendo su aumento un posible indicador, en la profilaxis renal, de una severa lesión tubular futura. Finalmente, en pacientes con GMSI, los controles de laboratorio deberán ser ajustados en su periodicidad pero no en su contenido. La mayor información así obtenida será lo que permitirá una decisión médica más segura al momento de recomendar la frecuencia del seguimiento del paciente y la consiguiente detección temprana de una evolución maligna de la enfermedad.

Electroforesis bidimensional en orina: una alternativa para el laboratorio clínico / Two dimensional electrophoresis in urine: an alternative for the clinical laboratory / Eletroforese bidimensional em urina: uma alternativa para o laboratório clínico

En este trabajo se presenta un método confiable para el análisis de rutina de proteínas urinarias. El método es la electroforesis bidimensional que combina la electroforesis en acetato de celulosa con la electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio seguida de tinción argéntica. La electroforesis bidimensional abre el espectro de proteínas, siendo algunas de ellas identificadas por immunoblotting o espectrometría de masa MALDI. Dichas proteínas son de bajo peso molecular: Orosomucoide (40 kDa), apolipoproteína AI (28 kDa), zinc-alfa 2-glicoproteína (43 kDa), fragmento del perlecan C-terminal LG3 (23 kDa), prostaglandina D2 sintasa tipo-lipocalina (29 kDa) e inter-alfa inhibidor de tripsina cadena pesada H4 (35 kDa). Estas proteínas están incluidas en estudios de falla renal aguda, falla renal crónica, trasplante renal, enfermedad glomerular y enfermedad maligna del tracto urogenital. El método, no invasivo, se aproxima a la tecnología emergente de la proteómica que permite el análisis simultáneo de varias proteínas urinarias como una herramienta para el diagnóstico y monitoreo de una variedad de enfermedades humanas.

Seguimiento del perfil proteico urinario en el trasplante renal / Follow-up of urine protein profile in renal transplant

La nefropatía crónica del trasplante (NCT) se caracteriza por fibrosis intersticial y atrofia tubular, pero su etiología es diversa. El objetivo del trabajo fue evaluar el seguimiento cualitativo de proteínas urinarias en pacientes con más de seis años de trasplante renal y compararlo con parámetros de laboratorio y con biopsia renal. Se evaluaron 17 pacientes durante un año, a través de creatinina sérica, proteinuria y fraccionamiento proteico por electroforesis en geles de poliacrilamida (SDS-PAGE) en una y dos dimensiones con coloración argéntica. Todos los pacientes con biopsias características de nefropatía crónica del trasplante presentaron un perfil tubular y aquellos con glomerulopatía del trasplante evidenciaron un perfil predominantemente glomerular. Los cambios en el perfil tubular se asociaron a infecciones urinarias, pulmonares e intestinales y a una respuesta inmunológica en el límite al rechazo (borderline), aún sin modificaciones evidentes en la creatinina sérica ni en la proteinuria. La electroforesis bidimensional permitió detectar claramente las proteínas orosomucoide y zinc alfa-2 glicoproteína, aparentemente asociadas a hialinosis arteriolar por toxicidad causada por ciclosporina. La electroforesis SDS-PAGE permitió identificar el sitio de lesión en el nefrón y cambios en la evolución, aún en presencia de vestigios de proteinuria. Las electroforesis SDS-PAGE mono y bidimensional se plantean como complemento para la evaluación de la condición clínica del paciente trasplantado renal crónico.

Post-transplant chronic nephropathy is characterized by interstitial fibrosis and tubular atrophy. These alterations are non-specific, but the glomerular and vascular lesions help to differentiate the etiological causes. The aim of this study was to determine the qualitative follow-up study of urine proteins in patients, six years after receiving a renal transplant, and compare their relationship to laboratory parameters and renal biopsy. The evolution of 17 patients with renal transplant was studied for one year, through serum creatinine, proteinuria, and polyacrylamide gel electrophoresis in the presence of sodium dodecylsulfate (SDS-PAGE) in one and two dimensions with silver staining. The patients with chronic nephropathy by renal biopsy presented a tubular profile of urinary proteins, and those who presented glomerulopathy showed a predominant glomerular profile. Changes in the tubular profiles during the follow-up study were associated to urinary tract, pulmonary, and intestinal infections, as well as borderline rejection, even without evident changes in either proteinuria or serum creatinine. The bidimensional electrophoresis clearly marked the orosomucoid proteins and zinc alpha-2 glycoprotein, generally associated to arterial hyalinosis due to ciclosporin toxicity. Even with traces of proteinuria, SDS-PAGE with silver staining made it possible to identify the renal lesion location. It also enabled the detection of the stable profiles of urinary proteins and changes in the evolution, without modification of serum creatinine. SDS-PAGE in one and two dimensions is used as a complement in the evaluation of renal transplant patients' clinical condition.

Validación post-analítica de la correlación inmunoglobulinas-gammaglobulinas / Post-analytical validation of the correlation between immunoglobulins-gammaglobulins

La electroforesis convencional en gel de agarosa con registro densitométrico (PRE) y la cuantificación de inmunoglobulinas IgG, IgA e IgM (GAM) por inmunoturbidimetría permiten estimar el estado inmunológico humoral. Debido a las diferencias metodológicas, los resultados de GAM y la densitometría de la fracción gamma obtenida ( GAMMA OBT) del PRE, son difíciles de correlacionar. El objetivo del presente estudio fue establecer una forma de validación post-analítica entre ambos métodos. Se seleccionaron 1.057 sueros, 736 no presentaban componentes monoclonales en la electroforesis. Se determinó GAM en un autoanalizador Hitachi 917 (Tina-quant-Roche, EE.UU.). La GAMMA OBT se obtuvo por electroforesis mediante un sistema semiautomático (Hydragel-Protein) seguido de densitometría (Hyrys), SEBIA (París-Francia). Mediante regresión lineal múltiple sobre GAMMA OBT y GAM de los 736 sueros, se predijo el valor esperado de la fracción gamma (GAMMA ESP) en g/dL a partir de los resultados de GAM: GAMMA ESP=0,84xIgG+0,23xIgA+0,75xIgM (Error estándar: 0,009; 0,041; 0,050, respectivamente; r=0,955; p<0,0001). Para detectar anomalías, como la presencia de componentes monoclonales, se utilizaron los 1.057 sueros, obteniéndose para la diferencia entre la GAMMA ESP y la GAMMA OBT, los siguientes valores de corte: -0,21 y +0,18 g/dL, los cuales incluyen la región de menor incidencia de anomalías. Se determinó el cociente de cada inmunoglobulina respecto de su valor normal superior, estableciéndose 1,5 como valor de corte. Combinando ambos procedimientos se obtuvo una sensibilidad y especificidad global de 81,4%, y 76,6%, respectivamente, para la detección de anomalías. En el presente trabajo se expone el algoritmo de decisiones que luego se ha aplicado a otros 307 pacientes encontrándose 68,0% y 83,1% de sensibilidad y especificidad, respectivamente.

Conventional agarose gel electrophoresis (AE) followed by densitometric analysis and quantitation of immunoglobulins IgG, IgA, and IgM (GAM) enable the evaluation of the immunological humoral status. Due to methodological differences, the results of the immunoglobulins quantitation by immunoturbidimetry (GAM), and the ones of the GAMMAAE region by densitometer tracing, are difficult to correlate. The aim of the present study was to establish a method of post-analytical validation between both procedures. One thousand and fifty-seven sera were selected, out of which 736 did not show any monoclonal components in the AE. GAM concentration was determined with a 917 Hitachi autoanalizer (Tina-quant-Roche). The GAMMA region was obtained by AE with a semiautomatic system (Hydragel Protein), followed by densitometer tracing (Hyrys, SEBIA). By means of the least-square multiple linear regression analysis of the GAMMA and GAM determinations of the 736 sera, the percentage fractions of each immunoglobulin corresponding to the GAMMA region were obtained: GAMMAGAM=0,84xIgG+0,23xIgA+0,75xIgM; (r=0.955; p<0.0001). In order to detect abnormalities such as the presence of monoclonal components, the 1057 sera were tested. The cut-off values for the normal difference between the GAMMAGAM and the GAMMAAEAE, were the following: -0.21;+0.18 (g/dL). The ratio of each immunoglobulin with respect to its higher normal value was determined, and the resulting cut-off value was 1.5. For the detection of abnormalities, a global sensitivity and specificity of 81.4%, and 76.6%, respectively was obtained by combining both procedures. In the present study the algorithm of decisions applied is shown.

Perfil proteico en líquido cefalorraquídeo: aporte al diagnóstico de esclerosis múltiple / Protein profile in cerebrospinal fluid: contribution to the diagnosis of multiple sclerosis

El presente estudio permitió determinar dos perfiles proteicos, mediante SDS-PAGE con tinción argéntica, en 104 líquidos cefalorraquídeos (LCR) de pacientes con diversas patologías. En el perfil A (PA) se observaron bandas de peso molecular (PM) 67 KDa. En el perfil B (PB) se observaron, además, bandas correspondientes a proteínas de bajo PM (20-25 KDa y 13 KDa). Se analizó la presencia de bandas oligoclonales (BO) mediante electroforesis y electroinmunofijación en acetato de celulosa con tinción argéntica, sin concentración previa. El análisis estadístico estableció una asociación entre la presencia de PB y esclerosis múltiple (EM) (p<0,0001) y la presencia de BO y EM (p<0,001) comparada con el resto de las neuropatías. Dentro del grupo de pacientes con PB se observó una asociación significativa entre la presencia de BO y el diagnóstico de EM (p<0,05). Tres pacientes sin EM presentaron BO positivas. El perfil proteico y la presencia de BO fueron útiles como herramientas diagnósticas adicionales para definir a la población de pacientes con EM. La utilización de ambas determinaciones fortalecería el aporte del Laboratorio al diagnóstico de EM, al evaluar dos eventos patológicos complementarios, la síntesis local de IgG (BO) y la destrucción axonal con liberación de proteínas de origen cerebral (PB)

Excreción de proteínas de bajo peso molecular en pacientes con proteinuria a cadena liviana como marcadoras de disfunción renal / Protein excretion of low molecular weight in patients with proteinuria to light chain like marking of renal dysfunction

Se determinó la excreción urinaria de las proteínas de bajo peso molecular (PBPM) beta-2 mocroglobulina(B2m), proteína transportadora de retinol (RBP) y alfa-1 microglobulina(A1m), en 65 pacientes con cadenas livianas monoclonales (CLM) en orina y en 47 con distintas enfermedades renales (DER), para evaluar la utilidad clínica de su determinación y el efecto de la presencia de CLM. Se utilizó inmunonefelometría (Beckman) para la determinación de Kappa, lambda y A1m, inmunoturbidimetría (Roche) para B2m y ELISA para RBP (Randox). La A1m correlacionó con los valores de CLM (r=0.49, p <0.01) y RBP (r=0.33, p <0.05). Las medias de PBPM mostraron diferencia significativa entre ambos grupos (p < 0.05); también entre la presencia o no de insuficiencia renal (IR) (p<0.001). Para A1m la diferencia fue significativa entre pacientes con y sin IR ( p<0.05 para CLM y p < 0.01 para DER). El número de pacientes sin IR con excreción aumentada de A1m mostró diferencias entre CLM y DER ( 80% y 35.7% ; p<0.01). En pacientes con CLM la alta excreción de PBPM en presencia o no de IR indicaría una disfunción tubular. En pacientes con CLM sin insuficiencia renal, A1m podría constituir una herramienta para el diagnóstico precoz de nefrotoxicidad.

Utilidad del método de rojo de pirogalol molibdato en la cuantificación de proteína de Bence Jones / Evaluation of pyrogallol-red molybdate complex performance in the measurement of Bence Jones protein

La cuantificación de proteínas en orina (PU) es un buen marcador para evaluar la función renal. En presencia de cadenas livianas libres monoclonales de inmunoglobulinas en orina (CLLM), o proteína de Bence Jones, el valor de PU provee un índice de la masa tumoral, de fundamental importancia en el monitoreo de pacientes con síndromes linfoproliferativos tales como mieloma múltiple micromolecular, enfermedad por depósito de cadenas livianas, y amiloidosis (AL). La determinación de PU por el método de unión al colorante Rojo de Pirogalol-Molibdato (RPM) es cada vez más utilizada porque es simple de realizar y fácilmente automatizable. El objetivo de éste trabajo es evaluar el comportamiento del método de RPM en la determinación de proteínas totales en muestras de orina compuestas por CLLM exclusivamente y estimar su correlación con otras metodologías de uso habitual. Se seleccionaron 79 muestras de orina de 24 h de recolección que presentaron solamente CLLM por electroinmunofijación (EIF) y por electroforesis en geles de poliacrilamida (SDS-PAGE). Se utilizó la técnica de Bradford con Azul Brillante de Coomasie (ABC), como otro método de unión a colorantes, y el método de Exton con ácido sulfosalicílico al 3 por ciento (ASS), de uso tradicional en éste medio. Para el método de RPM se utilizó un equipo comercial (RANDOX, Urinary Proteins) en un autoanalizador Selectra 2 Vitalab (Wiener). La cuantificación de cadenas livianas kappa y lambda se efectuó por inmunonefelometría (IN) (ARRAY 360 Beckman). El método de RPM tuvo una correlación estadísticamente significativa con el de ABC (r=0,888; ABC = 2,16 x RPM -0,09) y con IN (r= 0,790; IN = 11,9 x RPM + 0,16). El método de ASS correlacionó significativamente con el de ABC (r=0,324; p0,01) y con el de RPM (r=0,556; p<0,01), pero muy débilmente, por lo que no es posible vincularlos entre sí bajo aceptables intervalos de predicción. Se concluye que para la medición de las CLLM en los casos de orinas con concentraciones superiores al límite de linealidad del método de RPM, la mejor opción para evitar reacciones erráticas, es realizar una dilución 1/10 de la muestra

Auditoría: sistema de procesamiento de la información obtenida en la evaluación técnica en terreno / Audit: system of processing the information obtained by technical evaluations in field

Se aportan nuevos conceptos utilizados en un Programa de Acción Integral de Auditoría de Calidad para los laboratorios clínicos que atienden pacientes ambulatorios en su mayoría de la tercera edad. Estos programas son importantes para optimizar la calidad de las prestaciones brindadas por los laboratorios que participan en ellos. El mismo se basa en auditorías técnicas bajo procedimientos estrictamente sistematizados, con estándares establecidos, siempre compatibles con las normativas vigentes y el concepto de calidad total a fin de arribar a conclusiones objetivas y confiables que permitan emitir un juicio de valor, para tender a una mejora de la calidad. En éste trabajo se presenta un sistema de procesamiento de la información obtenida luego del relevamiento técnico en terreno, donde se utilizan indicadores para arribar en forma sistematizada a conclusiones con las que se confecciona un informe final, a fin de proponer acciones correctivas para contribuir a una mejora contínua de la calidad, en beneficio del paciente

Determinación de microproteínas urinarias en orinas sin concentrar / Urinary low molecular weight proteins on unconcentrated urine

Se realizó la determinación cuali y cuantitativa de las microproteínas urinarias (MU): Alfa-1 microglobulina (A1m), proteína transportadora del retinol (RBP) y Beta-2 microglobulina (B2m), en 138 orinas de 24 h de recolección con pH superiores o iguales a 5.5, en pacientes adultos con distintos cuadros uroproteicos: 38 fisiólogicos, 59 glomerulares, 19 tubulares y 22 mixtos. Se describe la metodología analítica para optimizar la detección de las MU mediante la técnica de electroinmunofijación (EIF) con coloración argéntica, en orinas sin concentrar. El rango de sensibilidad para las distintas MU fue de 3-100mg/l. La cantidad de antisuero monoespecífico empleado por cm2 de gel fue: anti-A1m (4µl/cm2), anti-RBP (4µl/cm2) y antiB2m (2µl/cm2). La determinación cuantitativa se relizó por inmunodifusión radial (IDR) para RBP y B2m, y por electroinmunodifusión (EID) para A1m. La detección de MU en orinas sin concentrar mediante esta metodología de alta sensibilidad y la cuantificación de las mismas permitieron efectuar un correcto diagnóstico de proteinuria tubular y mixta superando las eventuales pérdidas o desnaturalización protéica que acarrean los clásicos métodos de concentración. La detección elevada de A1m (15-65 mg/l) en 12 de 59 orinas con proteinuria glomerular, plantea un interrogante sobre la cuantificación aislada de la MU para definir un patrón tubular

Programa de Acción Integral de Auditoria de Calidad para el laboratorio Clínico: desarrollado para los laboratorios que atienden pacientes ambulatorios de INSSJyP en la ciudad de Buenos Aires / Total Quality Audit program for the Clinical Laboratories

El marcado incremento de la población anciana en el mundo y también en la Argentina, requiere de un crecimiento en los servicios de salud incluyendo los laboratorios clínicos, a causa del conocido aumento de enfermedades con el envejecimiento. Además, el cuidado médico de este sector de población se dirige principalmente hacia las áreas ambulatorias. Dos instituciones argentinas, una de ellas dedicada a la Seguridad Social, el "Instituto Nacional de Servicios Sociales para Jubilados y Pensionados" y la otra, la "Facultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad de Buenos Aires", trabajan juntas en el desarrollo de un Programa de Acción Integral de Auditoria de Calidad para los laboratorios clínicos, que atienden pacientes ambulatorios, en su mayoría mayores de 65 años. En el presente trabajo se describe el citado programa, detallando los principios, la metodología y las herramientas utilizadas, asi como los objetivos de calidad a alcanzar por su aplicación, con el fin de asegurar y mejorar permanentemente la calidad de las prestaciones de los laboratorios clínicos que participan en dicho programa. Es importante que los entes financiadores de la salud cuenten con laboratorios clínicos que cumplan satisfactoriamente programas de estas características para garantizar que sus prestaciones tienen el nivel de calidad fijado en sus objetivos fundamentales de atención al paciente y confiabilidad en los resultados